10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液

● 簡(jiǎn)介：

10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（10×Blue Native Transfer Buffer）適用于BN蛋白電泳后凝膠上非變性蛋白的轉(zhuǎn)膜。本轉(zhuǎn)膜液配制便捷，稀釋后無(wú)需調(diào)節(jié)pH值，pH約為7.5-7.7。該緩沖液最終可配成10升即用型1×緩沖液（根據(jù)需求補(bǔ)加甲醇）。

● 保存和運(yùn)輸：

粉末裝常溫保存，常溫運(yùn)輸，兩年有效；配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液后4℃貯存，一年有效；加入甲醇的即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液4℃貯存，一個(gè)月有效。

● 配制方法：

將10×轉(zhuǎn)膜緩沖液粉末全部溶解于1升超純水中，徹底溶解，即配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液。

根據(jù)下表配制成1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液

注：轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入甲醇對(duì)蛋白有固定作用，轉(zhuǎn)膜分子量較大的蛋白少加或不加甲醇，轉(zhuǎn)膜分子量較小的蛋白要加至多20%的甲醇。非變性蛋白的轉(zhuǎn)膜可以不加甲醇。

● 使用方法：

1. BN電泳介紹：

Blue Native PAGE（BN-PAGE）是一種從生物樣品（質(zhì)膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復(fù)合體從細(xì)胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來(lái)，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍(lán) G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負(fù)電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離。BN-PAGE由于考馬斯亮藍(lán)G-250存在，使蛋白都覆蓋上負(fù)電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）。BN電泳可以選擇Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(U型板3-12%預(yù)制膠，通用型)（貨號(hào)：RTD6139-0312或RTD6139-0416）

2. 電泳后凝膠預(yù)處理（可選步驟）：

凝膠浸泡于適量1×即用型BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（加終濃度0.1% SDS）中，搖床慢搖10分鐘。

注：凝膠浸泡在含SDS緩沖液中，能讓蛋白帶上更多的負(fù)電荷，有利于蛋白的轉(zhuǎn)膜。

3. 轉(zhuǎn)膜：

3.1轉(zhuǎn)膜方法：BN電泳后的轉(zhuǎn)膜建議用濕轉(zhuǎn)法。

3.2膜的選擇：BN電泳轉(zhuǎn)膜必須使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜會(huì)與考馬斯亮藍(lán)G-250不可逆結(jié)合，很難清除干凈）。根據(jù)蛋白大小選擇膜的孔徑。一般說(shuō)來(lái)，大于20 kD蛋白選擇0.45 μm孔徑，低于20 kD選擇0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前要用無(wú)水甲醇潤(rùn)濕活化。

3.3 三明治結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)膜相同，即根據(jù)“黑膠白膜”制作三明治，即膜置于轉(zhuǎn)膜夾芯正極一側(cè)，凝膠置于轉(zhuǎn)膜夾芯負(fù)極一側(cè)，這樣凝膠上帶負(fù)電荷的蛋白才能轉(zhuǎn)移到膜上。

蛋白轉(zhuǎn)膜三明治制作：

負(fù)極（電轉(zhuǎn)夾黑色面）-海綿墊-1層1 mm厚度濾紙-凝膠-膜-1層1 mm厚度濾紙-海綿墊-正

極（電轉(zhuǎn)夾白色面）

3.4 轉(zhuǎn)膜條件：

由于在非變性條件下，不同蛋白的空間結(jié)構(gòu)，聚合狀態(tài)，電荷數(shù)量都有不同，以下轉(zhuǎn)膜條件僅供參考，客戶針對(duì)自己的目的蛋白，最好經(jīng)過(guò)1-2次預(yù)實(shí)驗(yàn)后，確定最佳的轉(zhuǎn)膜條件。

4. 洗膜：

PVDF膜用無(wú)水甲醇清洗10分鐘，徹底去除藍(lán)色G250。

5. 進(jìn)行后續(xù)WB操作：封閉-一抗-二抗-檢測(cè)。