AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

● 產(chǎn)品組成：

●  產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35～36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素FITC 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

以每次使用5 μl Annexin V-FITC計(jì)算，本試劑盒FP2050M可以檢測(cè)50個(gè)樣品。

●  包裝組份：

●  保存條件：

4oC保存，一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。

● 操作步驟：

一. 懸浮細(xì)胞操作流程：

1.1 誘導(dǎo)凋亡的操作步驟 (以Jurkat細(xì)胞為例)：

1.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Jurkat細(xì)胞懸液。

1.1.2 加入終濃度為1 μM 的凋亡誘導(dǎo)劑 (STS，Staurosuporine，星孢菌素)。

1.1.3 在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。

注：1 μM Staurosuporine用于誘導(dǎo)Jurkat cell凋亡。最佳誘導(dǎo)條件請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞類型與誘導(dǎo)劑調(diào)整。

1.2 Annexin V染色操作步驟：

1.2.1 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，500 g（2500 rpm）離心3 min，去除上清液。

1.2.3沉淀中加入PBS，500 g（2500 rpm）離心 3 min，去除上清液。重復(fù)漂洗一次。

1.2.4加入Annexin V-FITC結(jié)合液，制成終濃度為1×10⁶ 個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

注：加入結(jié)合液的體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖孕姓{(diào)整，一般推薦不少于500 μl。

1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制備的細(xì)胞懸液，加入到一個(gè)新的離心管中。

1.2.6 向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

1.2.7 常溫下避光放置15 min，即為待檢液。

1.3 結(jié)果檢測(cè)：

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：

步驟1.2.7中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液。激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢測(cè)；PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測(cè)。注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3.2 熒光顯微鏡檢測(cè)：

取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液，封片觀察。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測(cè)。

二. 懸浮細(xì)胞操作流程：

2.1 誘導(dǎo)凋亡的操作步驟 (以Caco-2細(xì)胞為例)：

2.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Caco-2細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中。

2.1.2 在37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。

2.1.3加入終濃度為25 μM的凋亡誘導(dǎo)劑 (Cisplatin，順鉑)。

2.1.4 在37℃5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 days。

2.2  Annexin V染色操作步驟：

2.2.1吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中待用，細(xì)胞用PBS洗滌，加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2.2.2 常溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

2.2.3加入步驟2.2.1中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，2000 rpm 5 min，小心吸除上清。

注意：加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

2.2.4 細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞，2000 rpm 5 min，小心吸除上清；重復(fù)洗滌一次。

2.2.5細(xì)胞沉淀中加入適量Annexin V-FITC結(jié)合液，制成終濃度為1×10⁶ 個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

注：加入結(jié)合液的體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖孕姓{(diào)整，一般推薦不少于500 μl。

2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的細(xì)胞懸液，加入到一個(gè)新的離心管中。

2.2.7 向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

2.2.8 常溫下避光放置15 min，即為待檢液。

2.3 結(jié)果檢測(cè)：

2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：

步驟2.2.8中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液。激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢測(cè)；PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測(cè)。注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

2.3.2 熒光顯微鏡檢測(cè)：

取步驟2.2.8的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液，封片觀察。

檢測(cè)程序：

Jurkat細(xì)胞調(diào)整到1×10⁶/ml，6孔板接種2 ml；凋亡處理加10 μl 0.2 M STS（星型飽菌素），終濃度為1 μM；37度 5%二氧化碳培養(yǎng)3小時(shí)；2 ml收集，PBS漂洗2次，重懸于300 μl 結(jié)合液中；調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml制成細(xì)胞懸液。取100 μl細(xì)胞懸液加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液，RT 避光靜置15min，取5 μl加5 μl封片液，封片觀察。FITC（+）PI（+）為凋亡晚期細(xì)胞（40×）。

● 注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒適用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×10⁶，不推薦用于檢測(cè)組織樣本。

2. 推薦使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)。

3. 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。

4. 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-FITC，最終導(dǎo)致染色失敗。

5 .因檢測(cè)細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測(cè)儀器不同，因而流式檢測(cè)的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測(cè)均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。