EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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RTE4104
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EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
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30-60次
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● 產(chǎn)品組成：
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTE4104-01
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40%PAA(37.5:1)
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50 ml
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4℃，避光
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RTE4104-02
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5×TBE
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50 ml
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RT
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RTE4104-03
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80%甘油
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20 ml
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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5 ml
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RT（配制后-20℃貯存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
EMSA PAGE凝膠配制試劑盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制不同濃度的EMSA PAGE凝膠。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(也稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或電泳遷移率實(shí)驗(yàn))
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也稱Gel Shift，是一種用于研究蛋白與核酸相互作用的高靈敏實(shí)驗(yàn)技術(shù)。主要用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也可應(yīng)用于蛋白與DNA、蛋白與RNA相互作用研究。EMSA技術(shù)基于進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA或RNA復(fù)合物的遷移速度比游離線性DNA或RNA片段慢，從而導(dǎo)致DNA或RNA遷移位置在與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)滯后。
本試劑盒大約可以配制30-50塊常規(guī)大?。?×10 cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制60塊膠，1 mm厚度凝膠可以配制45塊膠，1.5 mm厚度凝膠可以配制30塊膠。
● 貯存和效期：
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸；按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說(shuō)明：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少常溫存放時(shí)間，以防失效，若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一、制備凝膠步驟：
1.1 參照凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。配制一塊常用EMSA PAGE膠(8×10 cm)所需凝膠溶液體積：0.75 mm厚度凝膠約5 ml；1 mm厚度凝膠約7 ml；1.5 mm厚度凝膠約10 ml。均含約0.5 ml的余量。
EMSA PAGE凝膠配方表一 (0.75 m厚度凝膠)：
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總體積5 ml，適用于厚度0.75 mm小板膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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3.8
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0.5
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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5%
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3.66
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0.625
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0.156
|
0.5
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0.05
|
0.005
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6%
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3.54
|
0.75
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0.156
|
0.5
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0.05
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0.005
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EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)：
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總體積7 ml，適用于厚度1 mm小板膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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5.3
|
0.7
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0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
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5%
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5.2
|
0.875
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
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6%
|
5.0
|
1.05
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
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EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)：
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總體積10 ml，適用于厚度1.5 mm小板膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
|
7.6
|
1
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0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
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5%
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7.4
|
1.25
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
6%
|
7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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1.3在玻璃板中灌入凝膠溶液至玻璃板頂端，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
1.4靜置20-60分鐘，等待凝膠完全聚合。
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環(huán)境溫度
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凝固時(shí)間
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低于18度
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＞60分鐘
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18度
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~40分鐘
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25度
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~30分鐘
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高于25度
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~20分鐘
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注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
二、電泳：
2.1預(yù)電泳：拔出梳子，用0.5×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。電泳槽內(nèi)外加入適量0.5×TBE緩沖液，穩(wěn)壓100 V預(yù)電泳10分鐘。
注：試劑盒配套的5×TBE緩沖液僅夠配制凝膠用，0.5×TBE電泳緩沖液請(qǐng)自己制備，配方如下：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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44.5 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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5.4 克
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27克
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1 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.372 克
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1.86克
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44.5 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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2.75 克
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13.75克
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4
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超純水最后定容至
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1 升
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5 升
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最后pH在8.2-8.3之間，可以不用調(diào)節(jié)pH，記錄每批pH
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2.2 把混合了無(wú)色上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10 μl稀釋好的1X的EMSA 上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
2.3 穩(wěn)壓100 V電泳，可以冰浴或4度條件下電泳，確保膠的溫度不超過(guò)30℃。電泳至上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。