細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒

Cell Counting Kit-8(CCK-8)

● 產(chǎn)品組成：

●  產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。 WST-8是一種類似于 MTT的化合物，在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被還原生成橙黃色水溶性的甲臜（Formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

WST-8與傳統(tǒng)的MTT，XTT，MTS，WST-1相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，反應(yīng)生成的formazan是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8更加穩(wěn)定，檢測(cè)線性范圍更寬，靈敏度更高。

本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。

本試劑盒檢測(cè)便捷，使用方便。僅含一管已經(jīng)配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無(wú)須再進(jìn)行任何配制等操作。無(wú)須使用同位素，所有的檢測(cè)步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細(xì)胞，不必收集細(xì)胞，也不必采用額外的步驟去溶解甲臜。特別適用于大批量樣品的檢測(cè)。

另外，酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無(wú)明顯影響。

WST-8對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，使檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于找到最佳測(cè)定時(shí)間。

本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)或500個(gè)樣品。

●  保存條件：

CCK-8 溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年，如長(zhǎng)期保存，可在-20℃下保存 2 年，如需經(jīng)常使用請(qǐng)將試劑存放在 0-5℃，為防止背景值增加干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)勿反復(fù)凍融。

● 操作步驟：

1.  在 96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl /孔)，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔約2000 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒

性實(shí)驗(yàn)每孔約5000 個(gè)細(xì)胞，具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。

2.  按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予0-10 μl特定的藥物刺激，處理一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如: 6,12,

24或48小時(shí))。

3.  每孔加入10 μl CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為200 μl，則需加入20 μl CCK-8溶液，以此類推。可以用加相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)基和 CCK-8但不加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，若擔(dān)心所使用的藥物會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)置加相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和 CCK-8 溶液但不加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。

4.  在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，具體時(shí)間可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、

2和4 小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.  用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值，若無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm 的濾光

片。如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，可以使用大于 600nm的波長(zhǎng)，例如650nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

6.  如果需要暫時(shí)不測(cè)定 OD值，可以向每孔中加入10 μl0.1MHCl 溶液或者1%(w/v)的 SDS溶液，避光保存在室溫，24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。  

● 注意事項(xiàng)：

1.  使用96 孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，請(qǐng)注意蒸發(fā)問(wèn)題?？蓪?6 孔板外圍一圈加培養(yǎng)基、水或 PBS保濕。同時(shí)，可以把96孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)靠近水盤的位置以緩解蒸發(fā)。

2.  培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而不同。在正式實(shí)驗(yàn)前，建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索鋪板的細(xì)胞數(shù)量以及加入CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

3.  鋪板時(shí)請(qǐng)注意保證每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)量均勻，建議鋪板過(guò)程中注意時(shí)常混勻，防止因細(xì)胞沉淀造成不均勻。加入CCK-8 后請(qǐng)前后左右輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次，使培養(yǎng)基和CCK-8 溶液充分混勻。

4.  本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性，可在加CCK-8  之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。若藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

5.  加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或 pH值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

6.  用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。

7.  本試劑盒系無(wú)菌灌裝生產(chǎn)。在使用過(guò)程中，請(qǐng)?jiān)谏锇踩駜?nèi)無(wú)菌操作，避免污染。

CCK-8

使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：

1. [2022 IF=2.6] Upregulation of Protease-Activated Receptor 2 Promotes Proliferation and Migration of Human Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs).

Author: Mei Wei, Yongsheng Liu, Mingqi Zheng, Le Wang, Fangfang Ma, Yanchao Qi, Gang Liu

Journal: Medicine Science Monotor. 2019; 25: 8854-8862

Institution：The First Hospital of Hebei Medical University

Paper link：https://www.medscimonit.com/abstract/index/idArt/917865