Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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包裝
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RTD6139-0312
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Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型板3-12%預(yù)制膠，通用型)
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10 次
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RTD6139-0416
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Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型板4-16%預(yù)制膠，通用型)
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10 次
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● 貨品內(nèi)容：
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組份
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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保存
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1
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RTD6138-0312
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3-12% RealPAGE Native BN/CN 預(yù)制膠
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10板
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4℃
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RTD6138-0416
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4-16% RealPAGE Native BN/CN 預(yù)制膠
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10板
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）
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500 ml
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RT
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3
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PL114
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電泳用）
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20 ml
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RT
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5
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BC260
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5% G-250染料（上樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質(zhì)膜，胞漿等）中非變性分離蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復(fù)合體從細(xì)胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來(lái)，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍(lán) G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負(fù)電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白的天然電荷和活性狀態(tài)，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍(lán)G-250存在，使蛋白都覆蓋上負(fù)電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只適合于酸性蛋白（pI＜7）的分離。
本產(chǎn)品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用?？梢杂糜诜蛛x分子量在 60 kD-1000 kD 的蛋白復(fù)合體，樣品可以來(lái)于胞漿、細(xì)胞總裂解液、細(xì)胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白純化、蛋白活性檢測(cè)等分析實(shí)驗(yàn)，也可直接用于電洗脫制備蛋白。
● 運(yùn)輸和貯存：
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸；組份按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說(shuō)明：
1. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關(guān)試劑，根據(jù)樣品種類(lèi)選擇不同提取方法。植物類(lèi)囊體BN樣品制備可以選擇植物類(lèi)囊體膜提取試劑盒（貨號(hào):RTU5002）；動(dòng)物總蛋白BN樣品制備可以選擇動(dòng)物胞漿活性蛋白提取試劑盒(貨號(hào):RTD8106)；動(dòng)物膜蛋白BN樣品制備可以選擇動(dòng)物膜蛋白提取試劑盒（貨號(hào):RTD8111,RTD8112）；動(dòng)物線粒體BN樣品制備可以選擇動(dòng)物線粒體提取試劑盒（貨號(hào):RTD8115和RTD8116)。
2. 電泳：
2.1 拆開(kāi)預(yù)制膠包裝，將預(yù)制膠安裝在合適的電泳槽中。
注：伯樂(lè)Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列電泳槽請(qǐng)確保密封條的安裝方向（下圖）。
六一其他系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預(yù)制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準(zhǔn)備電泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測(cè)定pH應(yīng)為7.0左右，不要調(diào)節(jié)pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
2.2.1 CN-PAGE電泳：
陽(yáng)極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進(jìn)行電泳。
2.2.2 BN-PAGE電泳：
陽(yáng)極緩沖液使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液按照下表配制：
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1×藍(lán)色陰極緩沖液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液
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15 ml
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2% G-250 染料（電泳用）
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1.5 ml
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超純水
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定容至150 ml
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2.3準(zhǔn)備樣品：
2.3.1 CN-PAGE電泳：
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總體積
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10 μl
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蛋白樣品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
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超純水
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補(bǔ)至10 μl
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不要加熱
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2.3.2 BN-PAGE電泳：
2.3.2.1 植物類(lèi)囊體膜蛋白電泳：
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總體積
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10 μl
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含去垢劑樣品*
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植物類(lèi)囊體膜蛋白樣品
（2%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
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5% G-250染料（蛋白上樣）
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1 μl
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超純水
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補(bǔ)至10 μl
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不要加熱
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*植物類(lèi)囊體膜蛋白電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
植物類(lèi)囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%，則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料1 μl。
2.3.2.2 動(dòng)物線粒體BN樣品電泳：
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總體積
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10 μl
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含去垢劑樣品*
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動(dòng)物線粒體BN樣品
（1%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
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5% G-250染料（蛋白上樣）
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0.25 μl
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超純水
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補(bǔ)至10 μl
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不要加熱
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*動(dòng)物線粒體BN樣品電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
動(dòng)物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
2.4電泳過(guò)程；
2.4.1 CN-PAGE電泳：
電泳內(nèi)外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔)，輕輕撥出預(yù)制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
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CN-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時(shí)間
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120V
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10-15mA/板膠
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4-10mA/板膠
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50+min
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注：冰浴電泳
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2.4.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；內(nèi)槽開(kāi)始電泳使用的是1×藍(lán)色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達(dá)凝膠1/3處時(shí)，將電泳緩沖液更換為1×BN/CN電泳緩沖液，繼續(xù)后續(xù)電泳，因?yàn)檫^(guò)多染料會(huì)影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后續(xù)的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。
BN-PAGE電泳條件（一板膠）
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恒電壓
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起始電流
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電泳時(shí)間
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緩沖液
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120 V
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8-15 mA
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20-25 min
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1×藍(lán)色陰極緩沖液
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冰浴電泳
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指示前沿至凝膠頂部三分之二處，更換內(nèi)槽緩沖液為1×BN/CN 電泳緩沖液
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恒電壓
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繼續(xù)電泳時(shí)間
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結(jié)束電流
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緩沖液
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120 V
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45 min +
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3-5 mA
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1×BN/CN電泳緩沖液
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冰浴電泳
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3. 轉(zhuǎn)膜：
BN-PAGE轉(zhuǎn)膜必須用PVDF膜，不能用NC膜，因?yàn)镹C膜與G-250結(jié)合非常緊密，不易去除。轉(zhuǎn)膜后PVDF膜上的藍(lán)色染料可以用無(wú)水甲醇漂洗去除。轉(zhuǎn)膜緩沖液推薦使用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：BC600P）。
4. 染色：
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適），條帶1-2分鐘即可見(jiàn)。
4.2 搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰可見(jiàn)。
4.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
4.4 觀察保存結(jié)果。
5. 實(shí)驗(yàn)示例：
BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩(wěn)壓120V 1.5 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳
BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓 120V 2 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳
K562 膜蛋白BN-WB檢測(cè)
樣品：膜蛋白提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨號(hào)：RTD8111，動(dòng)物膜蛋白提取試劑盒(細(xì)胞)） ，
胞漿蛋白CY做對(duì)照
電泳：3-12% BN預(yù)制膠（貨號(hào)：RTD6138-0312），穩(wěn)壓200V 1×藍(lán)色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無(wú)色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時(shí)間共83分鐘
膠預(yù)處理：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min后轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：BC600P）稀釋為1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時(shí)，未冰浴。
轉(zhuǎn)膜效果檢測(cè)：膜用麗春紅染色液染色（貨號(hào)：RTD6301）有可見(jiàn)條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號(hào)：RTD6202）幾乎無(wú)條帶，證明轉(zhuǎn)膜成功。膜用無(wú)水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍(lán)色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
圖1 一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光6秒
圖2 膜使用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號(hào)：WS1200）37度15min，快封10分鐘，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000 RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光1秒
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(RTD6139/RTD6138)
使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2021 IF=10.15] SlRIP1b
is a global organellar RNA editing factor, required for normal fruit
development in tomato plants
Author: Jinyan Li, Keru
Wang, Yongfang Yang, Yao Lu, Kaicheng Cui, Yajing Ji, Liqun Ma, Ke Cheng, Oren
Ostersetzer-Biran, Feng Li, Guiqin Qu, Benzhong Zhu, Daqi Fu, Yunbo Luo,
Hongliang Zhu
Journal: New
Phytologist 2023，Volume237, Issue4，F(xiàn)ebruary 2023，Pages 1188-1203
Institution： China Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1111/nph.18594
2.
[2022 IF=8.0] Tektin bundle interacting protein, TEKTIP1,
functions to stabilize the tektin bundle and axoneme in mouse sperm flagella
Author: Xinyan Geng,Huijuan Jin,
Lan Xia.Binbin Wang,Suren Chen
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2024)
81:118
Institution: Beijing
Normal University
Paper link：https://doi.org/10.1007/s00018-023-05081-3
3.
[2022 IF2.6] What are the main proteins in the hemolymph
of Haemaphysalis flava ticks?
Author: Dan Li , Lei Liu , Zi-ling Liu
, Yuan Tian , Xin Gao，Tian-yin Cheng
Journal: Frontiers in Veterinary Science Published 17
July 2024
Institution: Hunan
Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.3389/fvets.2024.1387719